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熒光定量技術原理
點擊次數:38 發布時間:2019-01-28
   熒光定量技術原理
 
  聚合酶鏈式反應(PCR)可對特定核苷酸片斷進行指數級的擴增。在擴增反應結束之后,我們可以通過凝膠電泳的方法對擴增產物進行定性的分析,也可以通過放射性核素摻入標記后的光密度掃描來進行定量的分析。無論定性還是定量分析,分析的都是PCR終產物。但是在許多情況下,我們所感興趣的是未經PCR信號放大之前的起始模板量。例如我們想知道某一轉基因動植物轉基因的拷貝數或者某一特定基因在特定組織中的表達量。在這種需求下熒光定量PCR技術應運而生。所謂的實時熒光定量PCR就是通過對PCR擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量PCR反應中,引入了一種熒光化學物質,隨著PCR反應的進行,PCR反應產物不斷累計,熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環,收集一個熒光強度信號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線圖。
 
  一般而言,熒光擴增曲線擴增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段,熒光信號指數擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,我們無法判斷產物量的變化。而在平臺期,擴增產物已不再呈指數級的增加。PCR的終產物量與起始模板量之間沒有線性關系,所以根據最終的PCR產物量不能計算出起始DNA拷貝數。只有在熒光信號指數擴增階段,PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系,我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便,在實時熒光定量PCR技術中引入了兩個非常重要的概念:熒光閾值和CT值。熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值,它可以設定在熒光信號指數擴增階段任意位置上,但一般我們將熒光域值的缺省設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍。每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數被稱為CT值。

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